流式細(xì)胞術(shù)在2020年歐洲血液學(xué)年會（EHA）上大放異彩

2020年新冠疫情全球肆虐，但疫情并未阻擋血液界學(xué)者對學(xué)術(shù)研究和交流分享的熱情。承載眾多看點的第25屆歐洲血液學(xué)協(xié)會（EHA）年會，在大家的期待中采用線上虛擬會議的模式如期舉行。

作為歐洲血液學(xué)領(lǐng)域規(guī)模最大的國際會議，EHA年會每年吸引來自全球100多個國家的上萬名專業(yè)人士與會，一起分享、探討有關(guān)血液學(xué)的創(chuàng)新理念及最新的科學(xué)和臨床研究成果，能夠登上EHA舞臺，表示在血液學(xué)領(lǐng)域具有較高的學(xué)術(shù)水平。此次，陸道培醫(yī)學(xué)團(tuán)隊有3項研究成果亮相EHA大會，向世界展示和分享陸道培醫(yī)學(xué)團(tuán)隊最新科研成果。

研究一：使用cCD79a設(shè)門的多色流式可以有效監(jiān)測CD19-CAR-T治療B-ALL后MRD，并且預(yù)測橋接移植的預(yù)后

第一作者流式細(xì)胞室陳曼醫(yī)師的文章“Multicolor Flow Cytometry Panel with cCD79A Gating to Detect Minimal Residual Disease in Patients with B-Lymphoblastic Leukemia/Lymphoma Post Anti-CD19 CAR-T Therapy Bridging to Allo-HSCT”（胞漿CD79a抗體設(shè)門多色流式法監(jiān)測CD19-CAR-T橋接異基因移植治療難治復(fù)發(fā)急性B淋巴細(xì)胞白血?。ㄕ枺篠113）被選為口頭發(fā)言。

陸道培醫(yī)療集團(tuán)在CD19嵌合抗原受體T(CD19-CAR-T)細(xì)胞治療急性B淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）中有豐富的經(jīng)驗，尤其是橋接異基因造血干細(xì)胞移植，挽救了無數(shù)難治復(fù)發(fā)患者生命。這類疾病的病情監(jiān)測、療效評價、預(yù)后評估中，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）微小殘留病變（MRD）檢測技術(shù)起到不可或缺的作用。

但是常規(guī)的B-ALL的MRD多色流式檢測方法均使用CD19設(shè)B細(xì)胞門，而CD19-CAR-T治療后，由于13-60%的MRD陽性或者復(fù)發(fā)患者腫瘤細(xì)胞會或多或少丟失CD19，故不再適合使用傳統(tǒng)方案監(jiān)測MRD。以王卉主任、陳曼醫(yī)師為代表的團(tuán)隊，探討了陸道培醫(yī)療集團(tuán)流式細(xì)胞室使用胞漿CD79a（cCD79a）抗體設(shè)門多色流式細(xì)胞術(shù)檢測MRD方法在CD19-CAR-T治療中的有效性，并研究其在輸注后橋接異基因移植（allo-HSCT）整個治療過程中的評價療效及監(jiān)測預(yù)后的作用。

CD19-CAR-T治療后CD19陰性MRD（紅色細(xì)胞群為腫瘤細(xì)胞群）

實驗中分別選取10例B-ALL完全緩解（CR）患者的骨髓標(biāo)本及10例B-ALL MRD陽性的骨髓標(biāo)本，同時使用新方案與經(jīng)典方案進(jìn)行檢測，采用線性回歸方法進(jìn)行結(jié)果一致性分析，證實兩種方案的一致性好。

然后選取2016年6月~2017年5月于河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院經(jīng)CD19-CAR-T細(xì)胞輸注后橋接移植的59例患者，使用新方案進(jìn)行骨髓MRD監(jiān)測，中位隨訪24月。其中51例（86.44%）患者CD19-CAR-T后FCM-MRD陰性，8例（13.56%）患者CAR-T細(xì)胞輸注后MRD陽性或者復(fù)發(fā)。兩組病例均在中位時間1-2個月左右進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植。

59例患者的臨床與預(yù)后情況

紅色為CD19-CAR-T后MRD陰性移植組患者，綠色為CD19-CAR-T后MRD陽性帶瘤移植組患者

經(jīng)單因素卡方檢驗分析，CD19-CAR-T后移植前以及移植后FCM-MRD均與移植預(yù)后有強(qiáng)相關(guān)性（分別為P＜0.0001，P=0.000）。59例患者中，移植后復(fù)發(fā)總計9例，其中7例死亡，4例為移植前FCM-MRD陽性患者（占帶瘤移植組50%，4/8例），3例為FCM-MRD陰性移植患者（占MRD陰性移植組5.88%，3/51例），2例復(fù)發(fā)后緩解均為移植前FCM-MRD陰性患者。

CD19-CAR-T治療后使用cCD79a方案多色流式檢測MRD結(jié)果可以有效預(yù)測橋接移植后生存：MRD陽性組預(yù)后差

結(jié)論認(rèn)為，使用cCD79a設(shè)門的多色流式B-ALL檢測MRD方案，可以有效監(jiān)測CD19-CAR-T后MRD，并且預(yù)測CD19 CAR-T后橋接移植的預(yù)后。

陳曼醫(yī)師，碩士研究生，主管檢驗技師、助理研究員。中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會檢驗學(xué)會流式細(xì)胞分析診斷專家委員會常務(wù)委員及秘書，北京醫(yī)學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會第一屆血液學(xué)和體液學(xué)檢驗分會委員、北京中醫(yī)藥協(xié)會第三屆中醫(yī)檢驗專業(yè)委員會青年委員。

研究二：流式細(xì)胞術(shù)微球法檢測24種細(xì)胞因子在CAR-T治療中的應(yīng)用

第一作者細(xì)胞凍存室王東出醫(yī)師的文章“EP403 Monitoring 24 Cytokines by Cytometric Bead Array during the Chimeric Antigen Receptor T Cells Treatment”（流式細(xì)胞術(shù)微球法檢測24種細(xì)胞因子在嵌合抗原受體T細(xì)胞治療中的應(yīng)用）被選為墻報展示。

研究表明在CAR-T治療中，多種細(xì)胞因子在細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）或者細(xì)胞因子風(fēng)暴中起到重要作用，因此細(xì)胞因子檢測是評價CAR-T副作用的重要指標(biāo)。流式細(xì)胞微球陣列技術(shù)（CBA）是最近發(fā)展起來的一項新技術(shù)，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，具有靈活、快速、高性價比、節(jié)約標(biāo)本等優(yōu)點。以王卉主任、王東出醫(yī)師為代表細(xì)胞凍存室團(tuán)隊設(shè)計了一項新的24種細(xì)胞因子組合方案，使用CBA方法評價了其在CAR-T患者的腦脊液和外周血細(xì)胞因子檢測中的作用。

他們首先進(jìn)行了方法學(xué)對照性研究，收集了29例健康志愿者的外周血，25例回輸CD19-CAR-T細(xì)胞后的ALL患者外周血標(biāo)本，分別使用ELISA（Quantikine,RND）檢測四種常見細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、IFN-γ、可溶性CD25（sCD25）），與CBA（北京曠博公司）方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，每種技術(shù)均有很好的重復(fù)性，兩者相關(guān)性很好。

為了研究CAR-T后細(xì)胞因子變化曲線，研究者選取的25例CAR-T治療患者每人至少采集了5個時間點。由于標(biāo)本量的問題，ELISA方法只做了正常對照和患者的外周血標(biāo)本，CBA方法除了檢測外周血標(biāo)本，還對41例未做CAR-T的完全緩解患者腦脊液標(biāo)本和15例CART治療后腦脊液標(biāo)本進(jìn)行了檢測。

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24種細(xì)胞因子CBA方法檢測CD19-CAR-T后腦脊液

綠色為對照組CR患者，紅色為CAR-T患者

CBA方法檢測CD19-CAR-T患者不同時間點外周血細(xì)胞因子

結(jié)果表明，在健康對照和患者外周血標(biāo)本組，雖然IL-6和sCD25檢測的絕對值兩種技術(shù)有差異，但是兩種方法均可滿意顯示CAR-T治療后細(xì)胞因子變化曲線，一致性很高。尤為重要的是，CBA技術(shù)檢測腦脊液和外周血均有臨床實用性強(qiáng)的特點。CBA方法可以一次完成24種細(xì)胞因子的檢測，因此節(jié)約標(biāo)本，讓腦脊液這種微量標(biāo)本檢測成為可能；各種標(biāo)本的檢測中都解決了ELISA方法必須批量檢測，隨意性差的特點，相比之下檢測時間短、性價比高，不論大批量還是急診隨機(jī)性標(biāo)本都適合。

2020年2月起，陸道培醫(yī)療集團(tuán)已經(jīng)將CBA方法24種細(xì)胞因子檢測技術(shù)全面推向臨床，這項技術(shù)不僅可用于CAR-T治療患者的監(jiān)測，同時在各種良、惡性疾病的診斷、治療，感染的免疫指標(biāo)評價，移植物抗宿主病、CMV、EBV或者其他感染等移植后并發(fā)癥的診斷、評價，噬血綜合征等特殊免疫狀態(tài)的監(jiān)測與防治中，都起到極為重要的作用。

陸道培醫(yī)療集團(tuán)細(xì)胞凍存室王東出醫(yī)師，University of Greenwich碩士研究生，助理研究員。

研究三：CD69在AML微小殘留病變檢測中的意義

第一作者流式細(xì)胞室宮美維醫(yī)師的文章“The Clinical Significance of CD69 Detection in Minimal Residual Disease of Patiens with Acute Myeloid Leukemia”（CD69在急性髓系白血病微小殘留病變檢測中的意義）被選為大會論文集。

微小殘留病變（MRD）是惡性血液病重要的疾病監(jiān)控、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療的指標(biāo)，目前臨床常用的靈敏度較高的檢測方法包括實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）、多色流式（MFC）等。MFC通過分析細(xì)胞抗原表達(dá)情況區(qū)分正常細(xì)胞與異常細(xì)胞，具有快速、性價比高、覆蓋范圍廣、靈敏度高、特異性高的特點。目前流式細(xì)胞術(shù)對急性髓系白血病（AML）檢測敏感性為10-3~10-4，雖然文獻(xiàn)報道覆蓋率為80-95%，但是臨床工作中低比例（低于0.1%）MRD檢測、以及缺乏特異性標(biāo)志的標(biāo)本檢測仍舊遇到瓶頸。以王卉主任、宮美維醫(yī)師為代表的流式細(xì)胞室團(tuán)隊進(jìn)行了一項研究，探討CD69在急性髓系白血?。ˋML）微小殘留病變（MRD）檢測中的臨床意義。

方法：采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測40例AML（包括初治AML及治療后MRD）患者骨髓中CD69的表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度，另選取10例MRD陰性的AML患者作為對照組。對照組患者經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、分子及遺傳學(xué)檢查證實其骨髓完全緩解狀態(tài)。CD69表達(dá)強(qiáng)度計算，采用每個患者同一管標(biāo)本中CD69陰性的淋巴細(xì)胞作為校準(zhǔn)參照，分別計算對照組正常髓系原始細(xì)胞和實驗組惡性髓系幼稚細(xì)胞CD69中位熒光強(qiáng)度（MFI）與其CD69陰性淋巴細(xì)胞CD69MFI比值（MFIR）。

CD69陰性和陽性的MRD，紅色細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞

結(jié)果：CD69在正常髓系原始細(xì)胞中不表達(dá)。在40例AML患者中，有17例（42.5%）CD69表達(dá)陽性或部分陽性。陽性病例腫瘤細(xì)胞MFIR為15.13+9.58，與對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

正常與惡性髓系原始細(xì)胞CD69中位熒光強(qiáng)度與CD69陰性淋巴細(xì)胞中位熒光強(qiáng)度比值（MFIR）,CD34+CD117+、CD34-/CD117+組為正常髓系原始細(xì)胞組，CD69陽性組和CD69陰性組為AML腫瘤細(xì)胞組，CD69陽性組MFIR高于CD69陰性組和正常對照組（P<0.01），后兩者無顯著性差異

結(jié)論：CD69可以作為一個新的AML特異性抗原加入MRD檢測方案中，并有望成為嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CAR-T）治療AML的一個新靶點。

陸道培醫(yī)療集團(tuán)流式細(xì)胞室宮美維醫(yī)師，碩士研究生，助理研究員，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會流式細(xì)胞分析診斷專家委員會秘書。

三篇文章的通訊作者均為陸道培醫(yī)療集團(tuán)檢驗科副主任、流式細(xì)胞室主任、信納克實驗室（CAP認(rèn)證實驗室）主任王卉教授。

陸道培醫(yī)療集團(tuán)檢驗科副主任、流式細(xì)胞室主任、信納克實驗室主任（副院長級）。中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會檢驗專委會流式專委會主任委員；北京醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)會血液和體液檢驗分會副會長；中國非公立醫(yī)療機(jī)構(gòu)協(xié)會血液委員會常委；中國臨床流式聯(lián)盟常委；中國抗癌協(xié)會淋巴瘤學(xué)組、中國血液免疫學(xué)會流式學(xué)組、中國生物工程學(xué)會細(xì)胞分析專委會、北京細(xì)胞生物學(xué)會等諸多學(xué)會常委、委員和特聘專家。從事流式臨床診斷19年，獨立簽發(fā)30余萬份報告；全國28個省（包括臺灣）講座600多場，為全國26個?。òㄅ_灣）百家三甲醫(yī)院培訓(xùn)了進(jìn)修醫(yī)。

科研創(chuàng)新，競勝之道。陸道培醫(yī)療集團(tuán)作為目前國內(nèi)最大的造血干細(xì)胞移植中心，擁有專業(yè)的病理和檢驗醫(yī)學(xué)團(tuán)隊，各實驗室之間緊密協(xié)作，及時為臨床一線醫(yī)生提供精準(zhǔn)的檢驗報告，為患者的正確診斷和治療爭取寶貴的時間，其檢驗報告的準(zhǔn)確性和易讀性得到業(yè)內(nèi)的廣泛認(rèn)可。